2026.08.12

AVATAR 应用案例｜缺氧高压微环境驯化：ahCAR‑T 体外实体瘤杀伤活性获得提升

嵌合抗原受体CAR-T 细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中展现出优异的治疗效果，但针对实体瘤的临床疗效存在明显局限，核心诱因之一是肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）介导的 T 细胞耗竭与细胞功能受损。肿瘤微环境具备缺氧、组织间隙高压等典型理化特征，能够决定性调控 T 细胞的生物学功能。基于体外构建肿瘤微环境模型对 T 细胞开展表型重塑与代谢重编程，是提升 T 细胞在实体瘤病灶内抗肿瘤效应的潜在新思路。

AVATAR Odyssey

本研究采用美国 Xcell Biosciences公司AVATAR Odyssey细胞培养系统，精准调控培养体系的氧气浓度与静水压，体外复刻肿瘤微环境的理化胁迫特征。实验选取四类效应细胞：未转导活化T细胞（UTD-ATC）、双特异性抗体修饰的未转导T细胞（BAT）、未修饰无头型CAR-T细胞(hCAR-T)、双特异性抗体武装无头型 CAR-T 细胞（ahCAR-T）。将各组细胞分别于常规培养条件（Normal Environment, NE，21% O₂）、AVATAR Odyssey 系统构建的模拟肿瘤微环境（低氧联合高压）中扩增培养，后续与肿瘤靶细胞进行共培养实验，系统性解析培养环境差异对 T 细胞增殖能力、免疫表型分化及抗肿瘤功能活性的作用。

实验方案

1. hCAR-T细胞培养条件

细胞复苏后，以可溶性抗CD3抗体（OKT3）联合100 IU IL-2过夜刺激，随后分组培养：标准培养箱（NE, 21% O₂，0 psi）、TME1（15% O₂，5 psi）、TME2（10% O₂，5 psi）、TME3（5% O₂，5 psi）。扩增8天后，流式细胞术检测hCAR表达、记忆亚群（T_CM/T_EM/T_EMRA/N_aive）、葡萄糖转运蛋白1（GLUT-1）及活化标志物CD69。

2. hCAR-T细胞功能检测

功能实验前，以OKT3/HER2双特异性抗体对T细胞进行武装。将HER2武装型hCAR-T细胞与HER2阳性靶细胞（LNCaP, PANC-1, SKBR-3, MCF-7）共培养。实验分为两组：NE组（标准培养箱）与TME组（AVATAR Odyssey, 1% O₂，2 psi）。效靶比从8:1开始，2倍梯度稀释，共培养72小时后流式细胞术检测肿瘤杀伤率。

实验结果

1. 不同培养环境下hCAR-T 细胞的 CAR 表达、增殖及表型分析

TME3条件（5% O₂，5 psi）下，hCAR表达中位值最高（50%），但T细胞扩增倍数随氧浓度降低而下降（NE :42倍 vs TME3:26倍）。值得注意的是，CD3⁺与CD4⁺T细胞以中央记忆T细胞（TCM）为主，而CD8⁺T细胞则以初始 T 细胞（T_Naïve）和终末效应记忆 T 细胞（T_EMRA）为主（图1）。

图1. 不同培养环境对CAR-T细胞功能表型和亚群的影响

2. 流式细胞术检测肿瘤微环境下 ahCAR-T 细胞的杀伤活性

流式细胞术结果显示，针对MCF-7、SKBR-3及PANC-1细胞，在低效靶比（2:1， 1:1）条件下，经TME扩增的ahCAR-T细胞展现出显著优于NE组及未武装组的肿瘤杀伤能力（图2）。

图 2. 常规环境（左）与肿瘤微环境（右）下各组细胞的体外细胞毒性检测

3. TME促进 CD8⁺T 细胞活化

流式细胞术分析表明，在AVATAR Odyssey模拟的TME条件（1% O₂，2 psi）下与靶细胞共培养后，CD8⁺ T细胞的活化标志物表达比例显著高于NE组（图3）。这表明TME驯化有助于维持或增强效应T细胞的活化状态。

图3. CD4⁺/CD8⁺T 细胞活化、耗竭标志物分析

4. 武装型hCAR-T与肿瘤细胞的结合诱导Th1型细胞因子/趋化因子

将MCF-7与四类T细胞（UTD、BAT、hCAR、ahCAR）共培养18小时后，检测上清液因子。热图显示，ahCAR-T细胞在与肿瘤抗原结合后，显著诱导了Th1型细胞因子（IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-2）、炎症性因子（IL-6）及多种趋化因子（MIP-1α/β、IP-10、RANTES等）的分泌，表明其具备重塑TME免疫微环境的潜力（图4）。

图4. 各组细胞共培养后细胞因子/趋化因子表达谱

实验结论

在TME扩增条件（5% O₂，5 psi）下，hCAR表达中位值（50%）显著高于常规环境
无论NE或TME，CD8⁺T 细胞始终以T_Naïve、T_EMRA亚群为主，表型稳定。
ahCAR-T与肿瘤细胞结合后，可分泌多种具备免疫调节及肿瘤杀伤作用的细胞因子、趋化因子。
流式细胞术检测结果显示，在TME（1% O₂和2 psi）条件下共培养的CD8⁺T细胞，各类活化标志物阳性率更高。

综上所述，借助 AVATAR Odyssey 系统在细胞体外扩增阶段模拟实体瘤微环境，能够显著增强 ahCAR-T 细胞的抗肿瘤杀伤功能与免疫调控能力，为实体瘤 CAR-T 细胞优化方向提供实验室数据支撑与可落地的技术方案。

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